一氧化氮在铁诱导的大鼠心肌损伤中的作用

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     浙江大学医学院生理教研室；杭州 310031 陈莹莹；夏强*；曹春梅；叶治国；沈岳良；王琳琳

    关键词：铁；心脏；一氧化氮；L-精氨酸；N-硝基-L-精氨酸甲酯

    摘要：采用Langendorff灌流大鼠心脏和酶解分离的心肌细胞为实验模型, 研究铁负荷下心肌损伤情况以及一氧化氮(NO)在铁诱导的心肌损伤中的地位。结果显示: (1)心肌铁负荷(Fe-HQ)可使分离心肌细胞舒张期细胞长度缩短、收缩幅度和速度降低, 离体灌流心脏左室发展压(LVDP)、 ±dp/dtmax、冠脉流量呈现双相变化; 冠脉流出液中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)释放量和心肌丙二醛(MDA)增高。 (2)NO的前体L-精氨酸(L-arginine, L-Arg)引起心肌细胞舒张期细胞长度缩短、收缩幅度降低。离体灌流心脏LVDP、冠脉流量、和±dp/dtmax增高, 用K-H液复灌后可恢复正常。 (3)L-Arg预处理, 再行Fe-HQ灌流, 与单纯的L-Arg或Fe-HQ组相比, 心肌细胞舒张期细胞长度、收缩幅度和速度减小; 离体灌流心脏LVDP、 ±dp/dtmax、心率和冠脉流量明显下降, 冠脉流出液中LDH、 CK增加。 (4)Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)和Fe-HQ合并灌流后, 与单纯Fe-HQ组相比, 心肌细胞舒张期细胞长度、收缩幅度和速度增加。L-NAME可阻断Fe-HQ引起的LVDP、左室舒张末压(LVEDP)和±dp/dtmax降低, 冠脉流出液中LDH、 CK增高。 (5)用Triton X-100短暂处理以去除冠脉内皮后, 与保留冠脉内皮的心肌相比, Fe-HQ引起的LVDP和±dp/dtmax的一过性增高现象被抑制, 但对复灌期LVDP和±dp/dtmax的改变无明显影响。上述实验结果表明, L-Arg可加重铁诱导的心肌损伤作用; L-NAME可通过抑制NOS减轻铁引起的心肌损伤, 其中冠脉内皮参与了铁的早期心肌作用。

    心肌缺血常见于急性心肌梗死的病人。实验证明, 心肌缺血后, 心肌细胞内的低分子量铁含量急剧增加, 约为正常的27倍, 心肌铁的增加是引起心肌缺血/复灌损伤的主要原因之一[1]。在许多组织和细胞中, 氧自由基(尤其是羟自由基·OH)的产生和增加被认为是铁诱导的损伤的共同机制。然而Oubidar等人研究表明, 将心脏暴露于Fe3+-HQ或枸橼酸铁, 冠脉流出液中的·OH并无明显增加[2]。心脏灌流液中·OH的产生量和心肌功能异常之间并无明显的相关性[3]。在缺血/复灌心脏, 超氧化物岐化酶和过氧化氢酶虽然可降低复灌期·OH的产生, 但并不能减少复灌引起的心律失常的发生率[4]。因此, 目前没有直接的证据证明·OH确实参与铁诱导的心肌功能不良。大量的研究表明, 铁和氧自由基可影响一氧化氮(NO)代谢产物的水平和NOS的表达。经脂多糖处理的动物体内, 铁可通过增加iNOS的活性增加肝脏、心脏和肾脏等组织中的NO的产生[5]。在原代培养的近曲小管细胞中, 铁可通过增加NOS活性和NO的产生, 导致细胞产生毒性[6]。在心肌细胞中, NO是否参与铁诱导的心肌损伤, 目前仍不明了。本实验的目的是, 在Langendorff灌流的大鼠心脏和酶解分离的成鼠心肌细胞上观察L-Arg和N-硝基-L-精氨酸甲酯 (N-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME) 在铁的心肌效应中的作用。

    1 材料和方法

    1.1 动物和试剂雄性Sprague-Dawley大鼠(220~270 g)由浙江大学实验动物中心提供。FeCl3·6H2O为上海金山化工厂产品。8-羟基喹啉(8-hydroxyquinoline, 8-HQ)、 L-Arg、 L-NAME和Triton X-100均为Sigma公司产品。临用前, 将FeCl3·6H2O与8-羟基喹啉按1:2的比例混合, 形成透膜的脂溶性复合物Fe-HQ[2]。

    1.2 离体心脏Langendorff灌流和左室功能评价雄性SD大鼠, 用木锤击昏后, 迅速取出心脏, 置于4℃改良Krebs-Henseleit溶液(K-H液)中除去血液; 然后迅速转移、固定于Langendorff灌流装置, 以改良K-H液行常规恒压灌流(76 mmHg)。改良K-H液成分(mmol/L): NaCl 118.0、 KCl 4.7、 K2PO4 1.2、 MgSO4 1.2、 NaHCO3 25.0、 CaCl2 1.25、葡萄糖10.0, pH 7.4, 以95% O2+5% CO2饱和, 维持灌流液温度于37℃[7]。采用左心室内水囊传递压力测定心室内压; 心电电极分别置于肺动脉圆锥及心尖部。通过MedLab生物信号采集处理系统记录心电图(ECG)和左室收缩曲线, 并计算左室舒张末压(LVEDP)、左室发展压(LVDP)、心率、 ±dp/dtmax。

    1.3 心室肌细胞酶解分离和收缩的测定用雄性SD大鼠(200~250 g)离体心脏行恒流灌流(流速为10 ml/min, 37℃)。先以无钙台氏液灌流5 min, 无钙台氏液成分(mmol/L): NaCl 100、 KCl 10、 KH2PO4 1.2、 MgSO4 5.0、葡萄糖 20.0、牛磺酸 20.0、 MOPS 10.0 (pH 7.2)。再以含Ⅰ型胶原酶0.35 mg/ml的无钙台氏液灌流11 min。然后将心室肌取下、剪碎、吹打, 复钙至终浓度1.25 mmol/L。静置2 h后, 取细胞悬液滴于玻璃底灌流槽中, 以改良K-H液按2 ml/min持续灌流, 溶液以95% O2+5% CO2饱和, 温度32℃。并施加频率为0.4 Hz、强度为两倍阈强度的电场刺激。用MedEase视频跟踪计算机图像分析系统, 记录并分析心室肌细胞的收缩幅度、 ±dL/dtmax和舒张期心肌细胞的长度。

    1.4 心肌损伤和脂质过氧化指标的分析在相应时点记录冠脉流量, 同时收集冠脉流出液, 用全自动生化分析仪(美国Beckman公司, CX-4型)分析其中乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的释放量。实验结束后取下心脏称重, 以硫代巴比妥酸法测定MDA, 用考马斯亮蓝法定量蛋白质。

    1.5 实验分组 A大组为酶解分离心肌细胞组, B大组为离体灌流心脏组。酶解分离心肌细胞(n=6)和离体灌流心脏(n=7~8)分别稳定15 min后, 行以下处理。对照组: 继续灌流45 min。Fe-HQ组: K-H液灌流5 min后, 用Fe-HQ (5 μmol/L)灌流10 min, 持续K-H液灌流30 min。L-Arg组: L-Arg (0.5 μmol/L)灌流5 min后, 再用K-H液灌流40 min。L-Arg+Fe-HQ组: L-Arg (0.5 μmol/L)灌流5 min后, Fe-HQ (5 μmol/L)灌流10 min, 再用K-H液灌流30 min。L-NAME+Fe-HQ组: K-H液灌流5 min后, 用Fe-HQ (5 μmol/L)和L-NAME (100 μmol/L)合并灌流10 min, 持续K-H液灌流30 min。Triton X-100处理组: 用0.1 ml Triton X-100 (0.05%)快速灌流心脏后[8], 以除冠脉内皮细胞, 再用Fe-HQ (5 μmol/L)灌流10 min, 持续K-H液灌流30 min。

    1.6 统计处理各组数据以mean±SE表示, 采用one-way ANOVA以及Newman-Keuls post hoc test做统计学分析。P<0.05认为有显著差异。

    2 结果

    2.1 Fe-HQ对酶解分离心室肌细胞和离体灌流心脏的作用

    用Fe-HQ灌流心肌细胞后, 引起舒张期细胞长度缩短、收缩幅度降低、 ±dL/dtmax减小 (P<0.01) 。Fe-HQ引起离体灌流心脏冠脉流量、 LVDP和±dp/dtmax双相变化, 即先增加, 随后逐渐降低(图2, 表1)。LVEDP明显增高(表2)。心率下降, 冠脉流出液中LDH、 CK的量增加, 心肌MDA增高(表3)。

    2.2 L-Arg对酶解分离心室肌细胞和离体灌流心脏的作用

    L-Arg引起舒张期心肌细胞长度缩短与收缩幅度降低。L-Arg灌流心脏5 min后, 可引起心脏LVDP、冠脉流量和±dp/dtmax增高。用K-H复灌后可恢复正常(表1)。

    2.3 L-Arg对Fe-HQ灌流心脏的作用

    L-Arg预处理心肌细胞5 min后, 用Fe-HQ进行灌流, 与单纯的L-Arg和Fe-HQ组相比, 舒张期心肌细胞长度缩短、收缩幅度降低, ±dL/dtmax减小; 但复灌时, 心肌细胞的收缩幅度和±dL/dtmax与单纯Fe-HQ组无区别。L-Arg+Fe-HQ灌流心脏组, 与单纯Fe-HQ或L-Arg灌流相比, LVDP、±dp/dtmax、心率和冠脉流量明显下降(图2, 表1), 冠脉流出液中LDH、 CK的量增加。但心肌MDA较单纯Fe-HQ组降低。

    表 1. Fe-HQ、 L-Arg、 L-NAME和Triton X-100对离体灌流心脏冠脉流量(ml/min)的影响。

    2.4 L-NAME对Fe-HQ灌流心脏的作用的影响

    用Triton X-100短暂处理以去除冠脉内皮后, 与保留冠脉内皮的心肌相比, Fe-HQ引起的LVDP和±dp/dtmax的一过性增高现象被抑制。但对复灌期LVDP和±dp/dtmax的改变无明显影响(图2), 冠脉流出液中LDH、 CK的量, 心肌MDA的含量与单纯Fe-HQ组相比无差异

    3 讨论

    本实验将铁与一种细胞可渗透性配基8-羟基喹啉结合形成复合物Fe-HQ, 它可以促进铁进入心肌细胞内并阻止铁重新转运出细胞, 从而增加心肌细胞内铁的浓度。用Fe-HQ灌流心脏15 min后, 铁的摄取量是从水溶性铁复合物(枸橼酸铁)摄取量的8~9倍[2]。将培养的内皮细胞在Fe-HQ中孵育15 min后, 74%的铁进入细胞[9]。本实验发现, Fe-HQ可引起灌流的离体心脏和酶解分离的心肌细胞的功能异常, 脂质过氧化程度增加, 而水溶性铁复合物对心肌功能影响明显小于Fe-HQ[10]。Fe-HQ引起心功能异常呈浓度依赖性关系, 当Fe-HQ的浓度达5 μmol/L时, 心肌损伤性的标志酶LDH和CK以及脂质过氧化程度明显增高。同样, 其他研究者的报道亦证明, 5 μmol/L是产生氧自由基的催化浓度[11]。心肌单纯暴露于8-HQ (10 μmol/L)对心脏的各指标并无明显影响。据报道, Fe3+-HQ易被细胞内的还原性物质(如坏血酸)所还原, 而在有氧情况下Fe2+-HQ可被快速氧化[12], 因此, Fe3+-HQ在心肌细胞内易发生还原-氧化反应。

    从本实验结果看, 铁和L-Arg联合使用可降低心肌收缩幅度、 ±dp/dtmax和±dL/dtmax等, 可能是由于铁抑制肌浆网ryanodine受体的结合特性, 导致外钙内流诱发的内钙释放减少[13]。而文献报道NO可降低心肌对β-肾上腺素激动剂的反应性, 导致钙瞬态下降[14], 故推测NO可直接或间接地加重铁对肌浆网钙释放的抑制, 或生成了更具毒性的物质, 从而影响心肌收缩功能。心肌铁和L-Arg联合使用可抑制铁诱发的LVEDP的增高, 可能与NO可增加肌浆网对钙的重摄取或影响线粒体钙泵的功能和活性有关。但目前缺乏直接的证据, 尚待进一步的研究。

    实验发现, 在离体灌流心脏和分离的心肌细胞模型上, L-Arg可加重铁引起心肌损伤, 而L-NAME可对抗铁负荷的心肌损伤作用, 提示NO可能中介铁诱导的心肌毒性。Kubrina等研究也表明, 铁剂不仅可使正常小鼠肝脏中的NO生成增加, 还可增加LPS预处理小鼠肝脏中的NO产生(10~20倍)。同样的情况发生在其他器官, 包括心脏、肝脏、小肠和肾脏等。NOS的抑制剂L-NNA可抑制LPS和经铁处理的小鼠各器官中NO的合成增加, 而L-Arg可增加LPS和铁引起的NO产生。已有证据, LPS和铁引起的NO产生依赖于L-Arg途径[5]。已知NO的形成依赖于多种NOS的活性。心肌细胞本身可表达内皮型NOS (eNOS), 并可能参与心肌收缩机制的调节。白介素1、脂多糖、儿茶酚胺、 cAMP、 γ干扰素均能诱导培养的乳鼠心肌细胞诱导型NOS (iNOS)的表达。eNOS的活性明显依赖于细胞内Ca2+浓度, 虽然iNOS的活性不依赖细胞内Ca2+浓度, 但其诱导过程也是Ca2+依赖性的。故推测铁引起的NO增加机制可能与铁引起细胞膜损伤, 导致Ca2+内流[15]和刺激Ca2+依赖性的NO生成或/和活性增加有关。

    关于NO对心血管系统的作用目前仍存在争议。一方面, NO可通过舒张血管平滑肌和心肌细胞, 调节血小板粘附和聚集, 保护心肌。另一方面, NO又具有致心肌损伤作用, 但其机制目前仍不明了。本研究表明, 在离体灌流心脏和分离的心肌细胞模型上, L-Arg可加重铁的心肌损伤作用。同样的现象存在于氧化应激的心脏, H2O2引起的冠脉流量增加是由NO介导的[16], 但NO可加重H2O2的心肌损伤作用[17]。其机制推测存在几种可能: (1)NO可与·O-2反应形成中间产物过氧亚硝基(ONOO-)。最近的研究表明ONOO-具有“双刃剑”作用[18], 即在低浓度(1~30 μmol/L)时, ONOO-可能通过抑制血小板聚集以及白细胞粘附来保护缺血心肌细胞的复灌期损伤; 而高浓度时, ONOO-可进一步分解生成高毒性的·OH, 增加膜的脂质过氧化和LDH的释放。ONOO-还可和CO2反应生成更具毒性的自由基(如·NO2和·CO-3)。推测本实验中可能由于L-Arg和铁联合作用产生大量高浓度的ONOO-, 对心肌细胞产生直接毒性作用。然而L-Arg处理的大鼠中, 心肌的MDA并不增加, 提示NO诱发的心肌细胞毒性与ONOO-和·OH所致的脂质过氧化无关。 (2) NO可直接和过渡金属铁发生反应, 氧化为亚硝酸盐和硝酸盐, 从而影响蛋白质的结构、功能和/或催化活性。NO的这些有害作用通过cGMP依赖和非依赖途径中介。

    冠脉内皮在参与心肌损伤作用中的地位目前仍无定论。实验表明, 心肌缺血/复灌损伤时, 冠脉内皮细胞的功能和形态均发生改变[19]。去冠脉内皮细胞的离体大鼠心脏缺血/复灌损伤减轻, 提示冠脉内皮在心肌损伤中发挥了重要的作用[20]。冠脉内皮是否参与铁对心肌的损伤作用？本实验用Triton X-100短暂处理以去除内皮细胞释放NO的功能, 发现Fe-HQ灌流早期引起的LVDP、 ±dp/dtmax等一过性增高被明显抑制。可见在灌流的心脏中, 冠脉参与铁所诱导的早期心肌作用, 但对于后期铁造成的心肌损伤作用并无明显影响。有研究表明, Ⅱ型糖尿病病人内皮依赖性的冠脉扩张受损, 冠脉流量下降。而铁的螯合剂去铁敏可使冠脉流量恢复以满足心肌能量需求[21], 推测这可能是由于铁中介了内皮细胞氧自由基的产生, NO生成降低所致。本实验室研究亦发现, 铁孵育离体有内皮主动脉环后, ACh诱发的冠脉舒张受损(论文投稿中)。可见铁引起的心肌早期收缩和冠脉流量一过性增加与血管内皮产生的NO无关, 但其机制目前仍不明了。从本实验结果看, L-Arg具有增加冠脉流量的作用, 而L-Arg和铁联合使用非但不能逆转铁引起冠脉流量下降, 反而使冠脉流量进一步降低, 推测其作用并不是简单的相加, 而可能是由于生成了更具毒性的物质, 导致内皮依赖性和非依赖性的冠脉舒张严重受损。因此, 心肌细胞本身的NO产生可能是铁的心肌毒性作用的主要机制。

    总之, 本实验观察证实, L-Arg可加重铁诱导的心肌损伤作用, L-NAME可通过抑制NOS减轻铁引起的心肌损伤, 其中冠脉内皮参与了铁的早期心肌作用。这些实验结果提示, NO可中介铁对心肌损伤的作用, 而与·OH和脂质过氧化程度增加无明显关系。

    参考文献

    [1] Voogd A, Sluiter W, van Eijk HG, Koster JF. Low molecular weight iron and the oxygen paradox in isolated rat hearts. J Clin Invest, 1992,90:2050~2055.

    [2] Oubidar M, Marie C, Mossiat C, Bralet J. Effects of increasing intracellular reactive iron level on cardiac function and oxidative injury in the isolated rat heart. J Mol Cell Cardiol, 1996,28:1769~1776.

    [3] Watts JA, Ford MD, Leonova E. [KG*3]Ironmediated cardiotoxicity develops independently of extracellular hydroxyl radicals in isolated rat hearts. J Toxicol Clin Toxicol, 1999,37:19~28.

    [4] Tosaki A, Bagchi D, Pali T, Cordis GA, Das DK. Comparisons of ESR and HPLC methods for the detection of OH. radicals in ischemic/reperfused hearts. A relationship between the genesis of free radicals and reperfusion arrhythmias. Biochem Pharmacol, 1993,45:961~969.

    [5] Kubrina LN, Mikoyan VD, Mordvintcev PI, Vanin AF. Iron potentiates bacterial lipopolysaccharide-induced nitric oxide formation in animal organs. Biochim Biophys Acta, 1993,1176:240~244.

    [6] Chen L, Zhang BH, Harris DC. Evidence suggesting that nitric oxide mediates iron-induced toxicity in cultured proximal tubule cells. Am J Physiol, 1998,274(1 Pt 2):F18~25.

    [7] Chen YY(陈莹莹), Shen YL(沈岳良), Cao CM(曹春梅), Xu WH(徐万红), Qian ZM(钱忠明), Xia Q(夏强). Hydrogen peroxide augments the injury effect of iron on the isolated rat heart and cardiomyocytes. Acta Physiol Sin(生理学报), 2001,53:175~182. (Chinese, English abstract).

    [8] Gattuso A, Mazza R, Pellegrino D, Tota B. Endocardial endothelium mediates luminal ACh-NO signaling in isolated frog heart. Am J Physiol, 1999,276(2 Pt 2):H633~641.

    [9] Balla G, Vercellotti GM, Eaton JW, Jacob HS. Iron loading of endothelial cells augments oxidant damage. J Lab Clin Med, 1990,116:546~554.

    [10] Chen YY(陈莹莹), Cao CM(曹春梅), Xu WH(徐万红), Shen YL(沈岳良), Qian ZM(钱忠明), Xia Q(夏强). Effect of iron loading on rat cardium. Chin J Pathophysiol (中国病理生理学杂志), 2002. (Chinese, English abstract).

    [11] Kontoghiorghes GJ, Piga A, Hoffbrand AV. Cytotoxic and DNA-inhibitory effects of iron chelators on human leukaemic cell lines. Hematol Oncol, 1986,4:195~204.

    [12] Oubidar M, Boquillon M, Marie C, Bouvier C, Beley A, Bralet J. Effect of intracellular iron loading on lipid peroxidation of brain slices. Free Radic Biol Med, 1996,21:763~769.

    [13] Kim E, Giri SN, Pessah IN. Iron(II) is a modulator of ryanodine-sensitive calcium channels of cardiac muscle sarcoplasmic reticulum. Toxicol Appl Pharmacol, 1995,130:57~66.

    [14] Ebihara Y, Karmazyn M. Inhibition of beta- but not alpha 1-mediated adrenergic responses in isolated hearts and cardiomyocytes by nitric oxide and 8-bromo cyclic GMP. Cardiovasc Res, 1996,32:622~629.

    [15] Anghileri LJ, Maincent P, Thouvenot P. Cardiotoxicity of parenterally administered iron complexes. Arzneimittelforschung, 1995,45:679~681.

    [16] Valen G, Skjelbakken T, Vaage J. The role of nitric oxide in the cardiac effects of hydrogen peroxide. Mol Cell Biochem, 1996,159:7~14.

    [17] Igarashi J, Nishida M, Hoshida S, Yamashita N, Kosaka H, Hori M, Kuzuya T, Tada M. Inducible nitric oxide synthase augments injury elicited by oxidative stress in rat cardiac myocytes. Am J Physiol, 1998,274(1 Pt 1):C245~252.

    [18] Ma XL, Gao F, Lopez BL, Christopher TA, Vinten Johansen J. Peroxynitrite, a two-edged sword in post-ischemic myocardial injury-dichotomy of action in crystalloid- versus blood-perfused hearts. J Pharmacol Exp Ther, 2000,292:912~920.

    [19] Lefer AM, Tsao PS, Lefer DJ, Ma XL. Role of endothelial dysfunction in the pathogenesis of reperfusion injury after myocardial ischemia. FASEB J, 1991,5:2029~2034.

    [20] Wu JL(吴基良), Xiang JZ(向继洲), Luo QF(罗启发), Hu BR(胡本容), Jin MW(金满文), Shen D(沈迪). The role of coronary arterial endothelial cells in myocardial injury during ischemia-reperfusion in the isolated rat heart. Acta Univ Med Tongji (同济医科大学学报), 1995,24(4):254~257 (Chinese, English abstract).

    [21] Nitenberg A, Ledoux S, Valensi P, Sachs R, Antony I. Inhibition of iron-catalyzed oxidative reactions restores matching between coronary blood flow and myocardial metabolic demand in type 2 diabetes. Arch Mal Coeur Vaiss, 2001,94:775~778. (文章出处：生理学报 2002年第4期第54卷)