聚合酶链反应技术进展及在优生与遗传产前诊断中的研究现状

来源：寻医问药网　寻医问药网

推荐阅读

聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR），又称体外基因扩增或无细胞分子克隆技术。1985年问世，1989年PCR及DNA聚合酶获Science年分子桂冠，1993年，该技术创建人美国Cetus公司人类遗传研究室Mullis获得诺贝尔医学奖。

一、PCR技术的进展

PCR技术十年来发展速度很快，许多新技术应运而生：巢式PCR、探针PCR、随机引物PCR、复合PCR等十余种已被广泛应用于医学研究各领域。PCR结合其它方法亦相继出现，如PCR/RFLP（ristriction fragment length polymorphism限制性片段长度多态性）；PCR/SSCP（single strend configulation polymorphism单链构象多态性）；PCR/DGGE（denaturant gradient gelelectrophoresis变性梯度凝胶电泳）；PCR/ASO(allele specific oligonucleotides等位基因特异寡核苷酸探针)；PCR/ELISA等用于分析基因结构。下面将有关最新发展及可提高检测特异性、准确性的新技术作一简介。

1、免疫PCR

1992年，Charles,R建议了一种新的抗原抗体检测系统，用一种双特异分子Streptavidin-protein A 融合蛋白连接生物素标记的DNA和抗原抗体分子，经扩增放大可检测少到一个抗原抗体水平，此即为免疫PCR。Maia，M用该法检测到血甭内亚pg水平HbsAg，比传统法提高了102-103倍。

2、竞争PCR

①引物竞争法：Gibbs用双对互相竞争的引物，A为野生型与正常DNA序列互补，B为突变型与单个或几个碱基突变的DNA序列互补。A与B等量加入PCR反应体系中，共同竞争靶序列上的同一复性位点。扩增后，经电泳及放射自为影，显带只能是完全互补且标记了同位素的引物所扩增的产物，由此检出点突变位点。

②模板竞争法：在一根试管内同时扩增二个不同的模板：竞争模板和检测模板。竞争模板可通过分子克隆、重组PCR、缺失法得到，并加以定量。两模板长度相近，有同样的引物识别序列，由此保证相同的热力学和扩增效率，其扩增产物通过凝胶电泳区分，并借助光学仪器检测两条带的相对强度，该法可用于PCR定量。

3、多重等位基因特异PCR（multiplex allele specific PCR）

这是多重PCR与等位基因特异的组合技术，其基本原理是将突变基因与正常基因所不同的那一个或几个碱基设计在PCR引物的3’端。当引物与模板完成互补时，PCR能从引物3’端开始链的延伸，反之，链就不能延伸。并设计多对引物同一反应体系中一次完成扩增。

4、PCR结合ASO分子杂交

此法可分为正、反两向，正身是标记探针，逐一对多份标本扩增产物杂交，适合于筛查。反向是标记扩增后产物，与固定于膜上的不同探针杂交，根据杂交与否鉴定标本性质，适合于个体标本突变基因分型诊断。

5、PCR结合RFLP分析

PCR扩增产物因其DNA顺序差异，可经限制性内切酶消化，并在凝胶电泳图谱中出现片段长度多态性，通过此多态性观察分析得知某基因是否有突变。该法已用于血友病、抗胰蛋白酶缺乏症及脆性X综合征等遗传病的DNA诊断。

6、PCR结合SSCP实验

PCR双链扩增产物经甲酰胺变性处理形成单链，单链DNA分子内部因碱基互补重新配对并折叠成不同空间构象。其序列中微小改变：点突变、缺失或掺入都会影响单链分子的终构象。在非变性凝胶电泳时可引起迁移率的改变，通过同位素或非同位素（如银染）标记检出变化。

7、PCR结合荧光或酶联免疫法测定

PCR扩增产物移入已包被有探针的酶标板内进行液相杂交，并按标记物不同进行荧光或酶标测量，此法可提高检测特异性和灵敏度。

一、PCR技术的应用

1、TORCH与优生产前诊断

TORCH（ToxRubCMVHSVHBVHIV）微生物通过血行至胎盘或产道上行引起宫内感染导致流产、死胎、畸形乃至青春期发育障碍已被高度重视。国外某些发达国家早就开始将TORCH病原体作为婚前检查项目，并实行登记制度，对阳性患者先行治疗再准予怀孕。国内陈诗书教授较早开展TORCH病原体PCR诊断研究，并在本刊TORCH与优生栏目作了系列报道。几年来，全国各地医院相继开展了TORCH病原体产前筛查检测。王梦玖等人应用PCR检测1340例孕妇，Tox-DNA10.5%。李上奎等人筛查106例孕妇，HCMV-DNA阳性31例，其中11例追踪查羊水、引产儿胎肝及脐血，均证实有HCMV感染。曾万江等人用ELISA IgM（+）作为筛选，结合PCR检测1186例孕妇，HCMV-DNA阳性率为6.32%，并指出：ELISA IgM（+）伴PCR（+）可作为孕妇活动性HCMV的标准更为合理准确。我院亦在1994年初开始对孕妇作TORCH病原体DNA产前诊断，共检测450例孕妇，Tox、HCMV及HSVⅡ阳性率分别为12.44%（56/450），4.89%（22/450）及4.67%（21/450），并观察到TORCH病原体混合感染或某病原体持续阳性者易危及胎儿生长发育，应考虑终止妊娠，积极治疗，确保优生。

PCR技术用于TORCH病原体产前筛查有着病毒培养法及血清学检查所不具备的优点：一是特异性高，Taq酶扩增产物与病原体DNA模板序列一致，碱基错配率一般约千分之一但不影响结果判断。二是敏感性高，可检测到pg水平的感染病原体DNA。三是快速无放射性，一般只需4小时就可完成全过程，有利于早期诊断。国内有些学者已开始结合使用ELISA-IgM筛选、套式PCR检测HCMV、地高辛标记探针分子杂交等方法用于提高TORCH PCR产前诊断的准确性，值得推广。

2、遗传病产前诊断

1985年Saiki等人第一个用PCR技术镰刀状红细胞贫血病的产前诊断获得成功，使该病的产前诊断比传统的Southern印迹术敏感性提高了二个数量。从此，遗传病的基因诊断技术有了突破性进展。1986年，吴冠芸教授在国内首先建立了PCR方法，几年来应用PCR技术成功地对α-地中海贫血、血友病、苯丙酮尿症及杜氏肌营养不良等多种遗传病进行了基因诊。断最近报道用MAS PCR法检测了30个苯丙酮症家系的5种苯丙氨酸羟化酶基因型先期分析中发现1例PKU风险胎儿，其绒毛组织经MAS PCR分析，确定为外显子7（Arg243 Gln）突变携带者。毛跃华等亦应用MAS PCR对21例β地中海贫血患者或携带者进行基因诊断，结果与PCR/ASO探针点杂交和DNA测序结果完全一致，由此完成了2例风险胎儿的产前诊断。吴元清等人应用9对引物多重PCR对9例DMD高危孕妇进行产前基因诊断，发现3例有基因缺失，其缺失部位与先证者相同。龙桂芳等人应用PCR/ASO对6种不同形式的α/β复合型地中海贫血高危胎儿12例进行产前诊断，获得较好结果。杜玲珍等人用PCR/RFLP法检测血友病甲等Ⅷ凝血因子发现第14个外显子1689核苷酸突变，认为该位点的突变是患儿Ⅷ因子功能缺陷的原因之一。

PCR扩增技术还可以结合DGGE或SSCP等方法，将未知突变锚定在一定范围（DNA片段）内，然后进行DNA测序分析“阳性片段”，可大大提高检测效率。迄今用PCR诊断的遗传病已有50多种，疾病谱也将越来越拓宽，可以预料，随着PCR新技术的不断涌现，必将对遗传病的产前诊断带来不可估量的作用。但这还需要先进的产前取样技术相结合。Monn和G对遗传病高危孕妇行早期绒毛取样的成功经验以及向阳对胎儿宫内取血进行产前诊断的专论报道都值得学习，以提高遗传病或宫内感染胎儿的产前诊断成功率。

二、PCR技术的困扰

PCR技术成功过程中的困扰主要是三个：假阳性、假阴性以及如何定量？值得研究商讨。

1、假阳性问题

PCR技术作为一种诊断工具最大优点是超凡的敏感性而这恰恰导致了其不可忽视的缺点：只要有几个靶DNA分子污染就会造成假阳性，辽是开展PCR最大困扰。Norrdhoek GT曾报道：约请荷兰、挪威、英国、韩国、瑞典等国7所实验室参加研究，比较其随机、单盲用PCR检测临床分支杆菌标本的能力，结果发现阴性做成阳性，7个实验室出现不同程度的假阳性，其可信度值得怀疑。美国公共卫生署作出结论：以现有知识，仍用传统诊断法。国内亦有学者提出：PCR在常规实验室应适当降温；有的还建议应停止临床应用PCR技术。的确，应用PCR检测临床微生物应十分慎重。每个PCR技术操作人员必须努力学习提高业务素质；必须养成严谨、严密认真的工作作风；必须要有强烈的防污染意识，积极探索，消灭假阳性。以下可供参考：①消除靶DNA的污染：可PCR扩增前或后用254-300nm紫外线照射工作台、实验室1小时，使胸腺嘧啶形成二聚体导致DNA链断裂，对250bp以上片段灭活作用较好。另使用1M稀盐酸溶液有美国器皿专门放丢掉的tip和eppendor’ftube，并经常更换。用1M过氯乙酸勤擦拭操作台、加液枪头及离心机内孔等，酸可使DNA脱嘌噙而失活。②准确判读阳性结果：Trainor提出四条阳性标准可借鉴Ⅰ 条带在期望的碱基大小之内；Ⅱ 条带在期望的碱基大小之内；Ⅲ背景上无smears也无引物二聚体出现，则是PCR扩增失败，而非阴性反应；Ⅳ 如果出现其它条带，不管是否有期望大小的条带，均应作为人工假象看待。③验证阳性结果，如果对阳性结果有疑问，可采取：重复PCR；套式PCR；有条件开展PCR/RFIP或PCR/ASO分子杂交分析。

2、假阴性问题

有时候阳性模板做成阴性结果，是何故？应考虑下列几点并加以改进①用NP非离子表面活性剂处理样本时，浓度不应超过0.45%，否则会影响Taq酶活性。②PCR扩增仪（尤其是水浴锅）设置温度应准确，每次扩增前应用标准水银温度计测试。③电泳槽内缓冲pH应经常测试，需稳定在pH7.8，籍以保护DNA，同样行石蜡切片标本PCR，其脱蜡、溶解标本DNA的缓冲液必须是pH7.8，防止DNA脱嘌呤而断裂。④蛋白酶K消化样本后应充分煮沸后离心，以去除干扰PCR扩增的外源污染物和抑制物。

3、定量问题

有时候，对PCR检出的病原体DNA是过客？还是真正的病因？是否达到致病的数量？强、弱阳性标准是什么？很有些困惑！面对这些问题，检测标本的核酸定量已显得十分必要。建议研究并使用内参标即标准模板，应用竞争PCR原理，与靶模板同时扩增，并研究二者的函数关系，由此标出模板核酸的量。有一定难度，比如标准模板来源，何种标记物，仪器投入怎样等，但相信随着PCR技术的深入开展，PCR定量问题必将通过创机关报得以解决。

最后希望国内尽快建立PCR质量控制中心，用标准参比品对实验质量进行监测，以促进PCR技术日臻完善，为人类医学事业作出更大贡献。

（来源：生殖协同网）