醛糖还原酶基因(AC)n二核苷酸串联重复序列不同等位基因的筛选

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     作者：李清解宋惠萍

    单位：李清解(生物化学教研室长沙 410078)；宋惠萍(生物化学教研室长沙 410078)

    关键词：微卫星序列；等位基因；醛糖还原酶；基因

    湖南医科大学学报000103 摘要：研究了醛糖还原酶基因转录起始点上游-2.1kb处的微卫星DNA标记--(AC)n二核苷酸串联重复序列7种等位基因(Z+6，Z+4，Z+2，Z，Z-2，Z-4和Z-6)的筛选方法。首先自人外周血提取基因组DNA后设计一对引物进行PCR扩增，获得长度为132～144bp的DNA片段。选取等位基因为纯合子的个体DNA标本的PCR扩增产物，经纯化后直接测序以确定等位基因的种类；并以确定的等位基因为标准，用尿素/甲酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳￣银染显色法对各种等位基因进行筛选。该法操作简便、快速、准确度高，利于大量标本的筛选，也适用于其它二核苷酸重复序列等位基因的筛选。

    分类号：Q523 文献标识码：A

    文章编号：1000-5625(2000)01-0009-03

    Screening of all types of alleles of (A-C)n dinucleotide tandem repeat

    sequence of aldose reductase gene

    LI Qing-jie, SONG Hui-ping

    (Department of Biochemistry, Hunan Medical University Changsha 410078)

    Abstract：The screening method of seven alleles (Z-6,Z-4,Z -2,Z,Z+2,Z+4 and Z+6) in the (A-C)n dinucleotide tandem repeat sequence was st udied. These alleles constitute a microsatellite DNA marker upstream of the tran scription initiation site on the aldose reductase gene. At first, genomic DNAs w ere isolated from leucocyte pellets, and the region containing the dinucleotide repeats was amplified by PCR with a pair of amplification primers that flanked 1 32～144bp region. Then, the PCR products of the DNA samples whose alleles belo nged to homozygotes were selected, purified, and sequenced directly in order to find out the types of alleles. Finally, using Z-2 allele as a marker, the sampl es containing Z-2 allele were detected by 12% fromamide-urea gel electrophores is together with silver-staining. This method is simple, quick and accurate. It facilitates the screening of a large number of samples and is also suitable for identification of other dinucleotide tandem repeat sequences.

    Key words：microsatellite DNA;alleles;aldose reductase;gene▲

    微卫星DNA(microsatellite DNA)一般具有高度多态性，常作为基因与疾病相关性研究的标记。作为多元醇途径的限速酶，醛糖还原酶(aldose reductase, AR, EC1.1.1.21)被认为与糖尿病慢性并发症有关。已发现在醛糖还原酶基因转录起始点上游-2.1kb处具有一个微卫星DNA标记--(AC)n二核苷酸串联重复序列^[1]。Ko等对香港的中国人^[1]以及Heesom等对英国白人^[2]的研究发现，(AC)n重复序列有7种等位基因，即Z+6，Z+4，Z+2，Z，Z-2，Z-4和Z-6，对应的重复数目n分别为27，26，25，24，23，22和21。Ko等发现，中国人2型糖尿病(NIDDM)患者中Z- 2等位基因出现出连锁不平衡；Heesom等则发现英国白人1型糖尿病(IDDM)患者中Z+2等位基因表现出连锁不平衡。因而提示中国人具有Z-2等位基因的NIDDM患者和英国白人具有Z+2等位基因的IDDM患者，其AR基因5′旁侧调控区可能发生了变异，值得进一步研究。

    要对可能发生的变异进行探索，首先必须筛选出含Z-2或Z+2等位基因的病人。Ko等^[1]和Heesom等^[2]采用的方法是提取基因组DNA后设计一对引物进行PCR扩增，其中上游引物用[γ-³²P]ATP进行末端标记，扩增产物经5%甲酰胺/尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶干燥后进行放射自显影，然后根据不同样品迁移距离的差异以确定各种等位基因。此法需大量使用放射性同位素，成本高，耗时长，不利于大规模筛选。

    针对上述问题，本实验室拟建立一套能简便、快速、准确筛选微卫星DNA等位基因的方法，对AR基因转录起始点上游(AC)n二核苷酸重复序列中的各种等位基因进行筛选。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 标本人外周血，包括正常人41例，2型糖尿病(NIDDM)患者53 例。样本均取自湖南医科大学附属湘雅医院。

    1.1.2 试剂 Taq酶为上海Sangon生物工程公司产品；测序试剂盒采用Pro mega

DNA Sequencing System,[γ- ³²P]ATP为北京亚辉生物医学工程公司产品；丙烯酰胺、尿素为上海Sangon生物工程公司进口分装产品；亚甲双丙烯酰胺为Serva公司产品。其它试剂均为市售分析纯。

    1.2 方法

    1.2.1 含(AC)n重复序列片断的PCR扩增自外周血白细胞中提取基因组DNA^[3]，设计引物5′-GAATCTTAACATGCTCTGAACC-3′及5′-GCCCAGCCCTATACCTAGT-3′ 进行PCR扩增，得长度132～144bp的DNA片断。PCR反应条件^[1]为预变性94℃ 3min，继之35个周期，循环条件为变性94℃ 1min，退火及延伸61℃ 1min。终末延伸10min。PCR产物与ΦX174DNA/HaeⅢ Markers行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，以初步确定目的产物的片断大小。

    1.2.2 用作筛选标准的等位基因的确定选取等位基因为纯合子、PCR产物在变性胶上迁移速度不同的DNA标本，行上述PCR反应后，用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化[4]。以此纯化回收片断为测序模板，以[γ-³²P]ATP-T4聚核苷酸激酶法标记上游侧引物，用Promega fmol^{○ R}DNA测序系统测序以确定样品所含等位基因的种类。经测序确定的等位基因再行变性胶电泳，以验证各种等位基因的大小顺序。

    1.2.3 各种等位基因的筛选用经测序证实的等位基因(如Z-2)为参考标准(marker)，以待筛选样品的PCR产物与该标准行12%尿素-甲酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳^[5]，随即银染^[6]然后将凝胶真空干燥。根据迁移距离确定所属等位基因。

    2 结果

    PCR扩增后得长度132～144bp的DNA片断(图1)。经测序确证了Z+4，Z+2，Z，Z-2及Z-4等 5种等位基因，其(AC)n重复数分别为26，25，24，23及22；碱基数分别为142，140，138 ，1 36及134(图2)。不同等位基因在变性胶上迁移速度与测序结果一致，即按Z+4，Z+2，Z，Z- 2及Z-4顺序碱基数递减，迁移速度递增(图3)。53例NIDDM患者与41例正常人中各种等位基因分布情况见附表。等位基因的筛选见图4(以Z-2为例)。

图1 PCR产物的鉴定 M：ΦX174DNA/Hae Ⅲ分子量标准；1～5：随机选取的正常对照样品；6～10：随机选取的2型糖尿病患者样品

Fig. 1 Identification of PCR products M : ΦX174DNA/HaeⅢ Markers; Lane 1～5: Control subjects selected at random; Lane 6～10: Patients with NIDDM selected at random

图2 Z-4，Z-2，Z，Z+2和Z+4 5种等位基因序列测定 5种等位基因的AC重复数n分别为22，23，24，25和26。

Fig. 2 Sequence analysis of 5 alleles Z -4,Z-2,Z,Z+2 and Z+4 Repeat numbers of 5 alleles are 22,23,24,25 and 26 respe ctively

    图3 Z+4，Z+2，Z，Z-2和Z-4五种等位基因在12%变性胶上迁移速度对比

    Fig. 3 Comparison of shift mobility on 12% denaturing gel of five alleles Z+4,Z+2,Z,Z-2 and Z-4

    图4 Z-2等位基因的筛选

    Fig. 4 Screening of Z-2 allele

    附表中国人AR基因(AC)n重复序列各种等位基因的分布^①

    Z-6

    Z-4

    Z-2

    Z

    Z +2

    Z+4

    Z+6

    total

    NIDDM患者(n=53)

    0

    0.066(7)

    0.236(25)

    0.302(32)

    0.2 74(29)

    0.104(11)

    0.019(2)

    1(106)

    正常对照(n=41)

    0

    0.098(8)

    0.256(21)

    0.329(27)

    0.2 32(19)

    0.073(6)

    0.012(1)

    1(82)^〓

    ①表中数据为百分率，括号内为染色体数

    3 讨论

    将PCR产物纯化后直接测序，测序模板作为筛选标准，充分保证了筛选结果的准确性。由于模板为(AC)n重复序列，不含G和T，采用手工测序可获得清晰的图谱。笔者采用银染显色法，既降低成本，又方便操作，可排除放射性同位素的污染。银染法操作简便、条带清晰且银染后的凝胶经真空干燥后可长期保存。由于在变性胶上AC链与GT链分离，故每个样品在变性胶电泳再经银染显色后均可见两条区带，但并不影响各种等位基因的筛选。对53例NIDDM 患者和41例正常人等位基因的筛选结果，即各种等位基因的分布机率，与Ko等人和Heasom等人报道的结果相符。由于Z-6等位基因出现的机率很小，故未曾筛获。通过与Ko等人的放射自显影图像^[1]比较可以看出，银染图像(图4)比放射自显影像区带更清晰。此法适用于其它二核苷酸重复序列等位基因的筛选。

    基金项目：国家自然科学基金资助资助课题(39670352)

    作者简介：李清解(1966-)，男，副教授

    参考文献：

    [1]Ko BCB, Lam KSL, Wat NMS, et al. An(AC)n dinucleotide repeat polymorphic marker at the 5′ end of the aldose reductase gene is associated with early-onset diabetic retinopathy in NIDDM patients[J]. Diabetes, 1995,44(7):727-732.

    [2]Heesom AE, Millward A, Demaine AG. Susceptibility to diabetic neuropathy in patients with insulin dependent diabetes mellitus is associated with a polymor phism at the 5′ end of the aldose reductase gene[J]. J Neurol Neurosurg Psych iatry, 1998,64:213-216.

    [3]Reardon W, Ross RJM, Sweeney MG, et al. Diabetes mellitus associated with a pathogenic point mutation in mitochondrial DNA[J]. Lancet, 1992,340:1376-1379.

    [4]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A Laboratory Manu al[M]. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989:6.36-6.44.

    [5]Litt M, Hauge XY, Sharma V. Shadow bands seen when typing polymorphic din ucleotide repeats: Some causes and cures[J]. Biotechniques, 1993,15(2):280-283 .

    [6]Budowle B, Chakraborty R, Giusti AM, et al. Analysis of the VNTR locu s DIS80 by the PCR followed by high-resolution PAGE[J]. Am J Hum Genet, 1991, 48:137-144.

    收稿日期：1999-02-06 (文章出处：湖南医科大学学报 2000年第1期第25卷)