电针和碱性成纤维生长因子(bFGF)对脑缺血时神经细胞的保护作用

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     复旦大学上海医学院针刺原理研究所；医学神经生物学国家重点实验室；上海 200032 李荣；郭景春*；程介士

    关键词：脑缺血；电针；碱性成纤维生长因子；神经保护作用

    摘要：采用暂时性脑缺血再灌注大鼠模型, 及H & E、 TUNEL细胞染色等实验技术, 观察电针或碱性成纤维生长因子, 以及两者合用对缺血性神经细胞死亡的影响。实验结果表明, 电针与碱性成纤维生长因子合用与单纯使用电针或碱性成纤维生长因子相比,可明显减少暂时性脑缺血再灌注后神经细胞坏死和凋亡。提示碱性成纤维生长因子与电针可具有互补或加强的神经保护作用。两者合用具有一定的临床实际价值。

    脑缺血后启动了机体神经损伤机制和神经保护机制, 这两种拮抗因素的对比决定了神经元的命运。缺血后, 作为脑内自身保护机制的神经营养因子bFGF、 aFGF、 NGF、 BDNF、 GDNF等的表达均有所增加。研究发现, 碱性成纤维生长因子(bFGF)在神经系统中的作用日益受到关注。bFGF对体外培养的大脑皮质、海马、丘脑、小脑、纹状体神经元具有维持存活, 促进神经轴索生长的作用[1~5]。整体实验也发现, bFGF可减少脑缺血后梗塞灶面积[6]。

    针刺作为我国传统医学中一种重要的治疗方法, 其抗脑缺血作用已得到确证。它的作用是多环节、多通道、多靶点的。我们曾发现, 大脑中动脉栓塞后, bFGF在纹状体和大脑皮层表达增加, 而电针可以进一步增加bFGF的表达[7]。这提示针刺抗脑缺血作用可能与bFGF有关, 设想两者合用可能加强对神经细胞的保护作用。本实验观察了电针与bFGF合用对缺血所致神经细胞死亡的影响, 为进一步探讨针刺与药物的结合是否加强抗脑缺血性损伤效果提供初步依据。

    1 材料和方法

    1.1 动物和分组 SD (Sprague-Dawley ) 大鼠(雄性, 清洁级, 250~280 g)由中国科学院实验动物中心提供。随机分为五组: (1) 单纯脑缺血组: 缺血2 h, n=5; (2) 电针治疗组: 缺血2 h, 缺血后15 min给予电针, 持续1 h, n=5; (3) 盐水对照组: 缺血2 h, 再灌后立即给予盐水, 方法同给药(bFGF)组, n=6; (4) bFGF组: 缺血2 h, 再灌后立即给药(详见后), n=6; (5) 针药合用组: 缺血后给予电针, 方法同电针组, 再灌后给予bFGF, 给药方法和剂量同单纯给药组, n=6。以上各组动物均在再灌24 h后, 心脏灌注多聚甲醛处死。

    1.2 脑缺血再灌注模型大脑中动脉栓塞(MCAO)模型, 采用Longa线栓法。SD大鼠用10%水合氯醛(0.33 ml/100 g)腹腔麻醉。术后动物给予不同处理。术前禁饮食12 h, 术中及术后麻醉状态时注意保温, 使直肠温度维持在37℃, 待动物苏醒后放回笼中, 自由饮食。

    1.3 电针参数及给药方法电针参数: 针刺人中, 百会两穴位; 用电针治疗仪(G6805-2型)疏密波输出, 密波: 6.25 Hz, 1.8~4.9 mA, 持续2.08 s,疏波: 3.85 Hz, 1.4~2.0 mA,持续1.28 s。给药方法: bFGF, 40 μg/kg, 股静脉匀速缓注。再灌后立即给药, 在3 h内匀速缓注完毕。

    1.4 H & E染色石蜡切片(片厚6 μm), 取Bregma -0.26 mm断面切片进行H & E染色。

    1.5 TUNEL染色取H & E染色的相邻切片进行TUNEL染色。TUNEL方法系以3’-OH末端DNA断裂点为阳性信号, 进行DNA双链损伤的检测。采用的原位检测细胞死亡碱性磷酸酶试剂盒购自Boehringer Maimheim 公司。

    1.6 图像及数据处理用Leica Q500IW图像分析仪和定量的软件操作系统, 对H & E染色切片做梗塞面积测定。数据以mean±SD表示, 采用t检验。

    2 结果

    2.1 对梗塞灶面积的影响

    H & E染色的脑冠状石蜡切片显示, 梗塞区的细胞核失去嗜苏木素的特性, H & E染色梗塞区和周围组织相比呈界限明显的苍白区域, 缺血组梗塞灶面积占同侧脑切片面积的(60.84±4.46)%, 盐水组为(56.83±7.97)%, 电针组为(41.45±3.36)%, bFGF组为(37.5±8.62)%, 针药合用组为(18.03±1.26)%, 即针刺或bFGF均可减小梗塞面积。

    2.2 对缺血侧残存细胞的影响

    用H & E染色的切片, 分别对各组缺血侧纹状体, 及自身对照侧(均为Bregma -0.26 mm水平)随机选取的三个高倍视野(×400)下测微框, 进行细胞计数, 测微框的面积为15625 μm2,求细胞数平均值。计算缺血侧与对照侧细胞数目的比例(缺血侧/对照侧)。

    单纯缺血组在梗塞灶内细胞脱失较明显, 残存细胞呈多种形态, 有的表现为核和胞浆的深染和固缩, 核膜不规则, 细胞多呈三角形, 胞浆强嗜伊红性; 也有细胞表现为鬼影细胞, 这些变化提示细胞发生坏死。有的细胞核呈圆形, 或核内染色质呈新月形, 这些细胞边缘光滑, 有完整的胞膜围绕, 胞浆非嗜伊红性。有的细胞胞膜犹如出芽一般包裹碎裂的核物质形成多个凋亡小体。电针和bFGF可明显增加残存细胞数目, 细胞形态较接近正常。针药结合进一步减轻神经损伤, 细胞丢失明显减少, 有较多正常细胞保留。

    2.3 对DNA双链断裂的影响

    用TUNEL染色的切片, 分别对各组缺血侧纹状体脑切片(Bregma -0.26 mm水平)随机选取三个高倍视野(×400), 计数测微框内的TUNEL阳性细胞数, 求平均值。计算TUNEL阳性细胞与 H & E染色计数的缺血侧细胞的比例(TUNEL(+)/ 缺血侧)。结果表明, 电针可使该比率从(87.05±11.79)% 减少至(64.52±12.34)%, 而应用bFGF亦可使其从盐水对照组的(77.11±8.41)% 减少至(49.49±10.12 )%,当针药合用时, 该一比率进一步减低到(23.61±5.24)%。

    3 讨论

    关于针刺治疗中风的疗效观察, 已有大量报道。我们在不同的动物脑缺血模型上均观察到针刺督脉穴位的神经保护作用[8,9]。临床上在中风急性期给予针刺治疗亦有明显疗效[10,11]。目前公认, 在受损神经细胞尚处于可逆性阶段时采取适当措施, 激活机体自身保护及修复机制, 可能对挽救尽可能多的神经细胞, 促进功能恢复具有重要的意义。一些研究表明, 给予外源性bFGF,有脑保护作用。其给药途径有两种: 脑室给药和外周给药。在动物脑缺血模型上, 脑室给予bFGF可有效地保护脑组织[7,12,13]。但脑室给药对于临床治疗推广有明显的缺点。外周给药在临床上应用方便, 但面临的问题在于bFGF是一种大分子量蛋白质, 有人怀疑其是否能通过血脑屏障。已有实验表明, 外周给药同样具有神经保护作用[14~16], 并观察到 bFGF可以通过血脑屏障。原因之一是, 这些作者采用的是新生鼠模型, 新生鼠的血脑屏障尚未发育完全; 之二是, 缺血后血脑屏障受到破坏, 通透性增加, 此时bFGF可以通过。以往认为bFGF不能通过完整的血脑屏障。但最近研究提示, 血脑屏障可能存在bFGF的转运体, bFGF可通过完整的血脑屏障[16]。这种转运体具有高度的立体构型特异性, 以前用来标记bFGF的放射性同位素可能改变了bFGF原有的立体构型, 所以未能检测到通过血脑屏障的bFGF。

    本实验采取在缺血后即及早给予针刺, 并结合再灌后外周静脉给予bFGF。实验结果表明, 电针和bFGF合用与单独分别给予电针或bFGF组比较, 可更显著减小梗塞灶面积, 增加神经细胞存活数、减少DNA双链断裂的发生。据文献报道, 电针和bFGF均作用于缺血后引起的瀑布式反应的诸多环节, 如电针可减少缺血后兴奋性氨基酸(谷氨酸、门冬氨酸)的释放[17]; 在大鼠海马细胞培养中, bFGF可提高谷氨酸神经毒性的阈值、降低谷氨酸引起的细胞内钙升高[18], 在整体模型上, bFGF可拮抗低氧缺血和NMDA 的神经毒性[19]; 在孵育的海马脑片上, bFGF可增强MK-801的抗缺血性神经细胞损伤作用[20], 并可抑制缺氧缺糖引起的突触前微电流的增强, 表明bFGF可减少谷氨酸的释放。电针还可在缺血后下调一氧化氮合酶信使RNA的合成, 直接降低NO生成[9]; 在培养的神经元中, bFGF也可拮抗NO毒性[21]。综上所述, 电针和bFGF可作用于相同的环节, 即电针和bFGF的作用有重叠的部分, 也有互补的部分; 关于bFGF加强电针的抗脑缺血的机制尚须进一步探讨。本实验证实了电针与bFGF合用可增强疗效, 为临床应用提供了一种有益的选择。

    参考文献

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